Determinación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp
Digital
- Autores:
-
Olarte Díaz, Andrés Felipe
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2021
- Institución:
- Universidad de Santander
- Repositorio:
- Repositorio Universidad de Santander
- Idioma:
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- OAI Identifier:
- oai:repositorio.udes.edu.co:001/5523
- Acceso en línea:
- https://repositorio.udes.edu.co/handle/001/5523
- Palabra clave:
- Péptidos Antimicrobianos
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Cruz Laitón, Jenniferba0b1d86-666e-468a-a825-9bb8f7e48956-1Rueda Forero, Nohora Julianafdefebdb-5a74-4c59-ba33-4ff4cc09bca4-1Suárez Barrera, Miguel Orlando335becb1-2371-418a-acf8-21265141ac00-1Olarte Díaz, Andrés Felipe181bc8f3-a637-44d6-aea6-229c27a1df06-12021-08-20T16:12:51Z2021-08-20T16:12:51Z2021-02-11DigitalBacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por producir cristales parasporales -proteínas Cry- con efectos insecticidas frente a plagas. Sin embargo, en los últimos años se ha documentado que un grupo de proteínas Cry no presentan actividad insecticida o hemolítica, presentan actividad frente a bacterias o células cancerígenas. Aunque el mecanismo de acción de este grupo de proteínas no se ha elucidado completamente, la fragmentación de ésta en péptidos, acompañada con un soporte computacional pueden dar luces de los sitios de unión o la forma de internalización celular. La característica anfipática de este grupo de compuestos, péptidos, es crucial para la interacción con la membrana, donde las cargas positivas en este grupo de moléculas son importantes para generar selectividad, al interactuar de formas distintas con las membranas bacterianas, que están densamente poblados por fosfolípidos con carga negativa. Por consiguiente, pueden tener una alta probabilidad de ser antimicrobianos. Basados en estas consideraciones, en este estudio se evaluó la actividad de tres fragmentos peptídicos derivados de la proteína Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, bacteria que se caracteriza por afectar los cultivos de interés en la región nororiental de nuestro país. Inicialmente, se realizó una cinética de crecimiento para conocer el tiempo de duplicación de la cepa fitopatógena y se evaluó la actividad hemolítica de cada uno de los compuestos. Así mismo, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los péptidos frente a la bacteria anteriormente mencionada. Adicionalmente, las concentraciones analizadas de los compuestos fueron en un rango de concentración de 4 a 150μM, siendo el péptido Loop2-PS2Aa el más bioactivo obteniendo porcentajes de inhibición de 44.41% y 51.98% a las concentraciones de 100 μM y 150 μM, respectivamente. Asimismo, se evaluaron concentraciones más altas para este compuesto. Se empleó el agroquímico Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl) como control positivo a las mismas concentraciones que los péptidos mostrando una menor inhibición a concentraciones bajas en comparación con el péptido Loop2-PS2Aa. Sin embargo, a la concentración recomendada (2g/L o 9364.6 μM) para tratar especies fitopatógenas de Pseudomonas sp inhibió el 99.9% de crecimiento, siendo esta la CMB. Con los resultados obtenidos se pretende recopilar información acerca de posibles fragmentos bioactivos de la toxina Cry46Aa1 del dominio I, que aún no se han evaluado frente a bacterias fitopatógenas.Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive, aerobic bacterium characterized by producing parasporal crystals -Cry proteins- with insecticidal effects against pests. However, in recent years it has been documented that a group of Cry proteins do not show insecticidal or hemolytic activity. They show activity against bacteria or cancer cells. Although the mechanism of action of this group of proteins has not been fully elucidated, its fragmentation into peptides, accompanied by computational support, can shed light on the binding sites or the form of cellular internalization. The amphipathic characteristic of this group of compounds, peptides, is crucial for the interaction with the membrane, where the positive charges in this group of molecule are important to generate selectivity, by interacting discriminatively with bacterial membranes, which are densely populated by phospholipids with negative charge. Consequently, they may have a high probability of being antimicrobial. Based on these considerations, this study evaluated the activity of three peptide fragments derived from the Cry46Aa1 protein called: P264-G274, Loop1-PS2Aa and Loop2-PS2Aa against phytopathogenic species of Pseudomonas sp, a bacterium that is characterized by affecting cultures of interest in the northeastern region of our country. Initially, growth kinetics were performed to determine the doubling time of the phytopathogenic strain and the hemolytic activity of each of the compounds was evaluated. Likewise, the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of the peptides against the aforementioned bacteria were determined. Additionally, the analyzed concentrations of the compounds were in a concentration range of 75 to 150μM, with the Loop2-PS2Aa peptide being the most bioactive, obtaining inhibition percentages of 44.41% and 51.98% at concentrations of 100 μM and 150. μM, respectively. Also, higher concentrations were evaluated for this compound. The agrochemical Copper Oxychloride (Cu2(OH)3Cl) was used as a positive control at the same concentrations as the peptides, showing less inhibition at low concentrations. However, at the recommended concentration (2g/ L or 9364.6 μM) to treat phytopathogenic species of Pseudomonas sp, it inhibited 99.9%, being this the CMB. The results obtained are intended to gather information about possible bioactive fragments of the Cry46Aa1 toxin from domain I, which have not yet been evaluated against phytopathogenic bacteria.PregradoMicrobiólogo Industrial1 ed.Resumen ........................................................................................................................................ 13 Abstract ......................................................................................................................................... 15 1 Introducción ...................................................................................................................... 17 2 Planteamiento del Problema ............................................................................................. 20 3 Justificación ...................................................................................................................... 23 4 Pregunta de Investigación ................................................................................................. 25 5 Marco Teórico ................................................................................................................... 26 5.1 Especies de Pseudomonas Patógenas en Plantas .................................................. 26 5.1.1 Descripción ............................................................................................... 26 5.1.2 Caracterización ......................................................................................... 28 5.1.3 Patogénesis ................................................................................................ 29 5.2 Impacto Ambiental por Utilización de Agroquímicos .......................................... 32 5.3 Proteínas Cry y Péptidos Antimicrobianos Derivados Como Alternativa de Agroquímicos Comerciales ............................................................................................... 33 5.4 Actividad hemolítica ............................................................................................. 35 6 Marco Legal ...................................................................................................................... 36 7 Objetivos ........................................................................................................................... 38 7.1 Objetivo General ................................................................................................... 38 7.2 Objetivos Específicos............................................................................................ 38 8 Hipótesis ........................................................................................................................... 39 8.1 Hipótesis de Investigación .................................................................................... 39 8.2 Hipótesis Nula ....................................................................................................... 39 8.3 Hipótesis Alternativa ............................................................................................ 39 9 Metodología ...................................................................................................................... 40 9.1 Diseño de Estudio ................................................................................................. 40 9.2 Esquema Metodología .......................................................................................... 40 9.3 Materiales y Métodos ............................................................................................ 40 9.3.1 Propiedades fisicoquímicas de los péptidos .............................................. 41 9.3.2 Activación de la cepa HSL30 ................................................................... 42 9.3.3 Cinética de crecimiento............................................................................. 42 9.3.4 Estandarización del inoculo mediante absorbancia .................................. 43 9.3.5 Ensayo de actividad antimicrobiana ......................................................... 44 9.3.5.1 Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50). ................... 44 9.3.5.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB). .............................. 45 9.3.6 Determinación del porcentaje de hemólisis de los péptidos nativos en eritrocitos de humano ............................................................................................ 45 9.3.7 Análisis de los resultados .......................................................................... 46 10 Resultados y Discusión ..................................................................................................... 47 10.1 Estructura Secundaria In Silico de los Péptidos .................................................... 47 10.2 Cinética de Crecimiento de Pseudomonas sp Fitopatógena ................................. 49 10.3 Actividad Antimicrobiana de Péptidos Frente a Pseudomonas sp Fitopatógena . 55 10.4 Actividad Hemolítica de los Péptidos en Eritrocitos Humanos ............................ 62 11 Conclusiones ..................................................................................................................... 65 12 Recomendaciones ............................................................................................................. 66 13 Referencias Bibliográfícas ................................................................................................ 67 14 Apéndices .......................................................................................................................... 7679 papplication/pdfT 33.21 O157dhttps://repositorio.udes.edu.co/handle/001/5523spaBucaramanga : Universidad de Santander, 2021Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y AgropecuariasBucaramanga, ColombiaMicrobiología IndustrialDerechos Reservados - Universidad de Santander, 2021info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Péptidos AntimicrobianosProteínas CryActividad AntimicrobianaPseudomonas spAntimicrobial PeptidesCry ProteinsAntimicrobial ActivityDeterminación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas spTrabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPhttp://purl.org/coar/version/c_71e4c1898caa6e32Todas las AudienciasAlippi, A., Lopéz, A., Rollan, M., Ronco, L., & Aguilar, O. 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