Evaluación de genes normalizadores para la cuantificación de la expresión génica en ensayos de diferenciación de células madre de médula ósea hacia el linaje osteogénico

56 páginas

Autores:
García Quiroz, Felipe
Tipo de recurso:
Fecha de publicación:
2008
Institución:
Universidad EIA .
Repositorio:
Repositorio EIA .
Idioma:
spa
OAI Identifier:
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Acceso en línea:
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En el caso de las células madre mesenquimatosas de la médula ósea humana (BMSCs), una de las líneas de células madre adultas más utilizadas, no se han publicado trabajos sobre la validación de estos genes normalizadores que permitan estudiar su diferenciación hacia el linaje osteogénico, pese a que se encuentran un buen número de estudios sobre la caracterización de dicho proceso mediante RT-qPCR. En el presente trabajo se evaluó la estabilidad en los niveles de expresión de los genes constitutivos β-actina, GAPDH y RPLI3A, para ser utilizados como genes normalizadores en ensayos de expresión génica de BMSCs bajo condiciones de diferenciación hacia el linaje osteogénico, utilizando la RT-qPCR luego de 14 y 20 días de cultivos con y sin medio osteogénico (MO), y verificando su capacidad de mineralizar la matriz extracelular. Además se cuantificaron los marcadores osteogénicos Colágeno Tipo I, Sialoproteina Ósea y Osteonectina, y se evaluaron los efectos de distintas estrategias de normalización sobre los patrones de expresión génica de estos marcadores. Los resultados confirmaron el potencial osteogénico de la línea de BMSCs establecida así como la inestabilidad del gen β-actina (p<0,0001) bajo las condiciones de diferenciación, con cambios de hasta 4,38X luego de 20 días de cultivo. La expresión de los genes GAPDH (p=0,2045) y RPLI3A (p=0,8384) no se vio afectada luego de 14 días de tratamiento con MO, aunque al día 20 se observaron cambios mínimos, con variabilidades máximas inferiores a 2X. El gen RPLI3A mostró menor variabilidad que el GAPDH, al analizar los niveles de expresión en función del tiempo de tratamiento con MO. Lo anterior se confirmó con los patrones de expresión de los marcadores osteogénicos, donde sólo RPLI3A permitió obtener un patrón de expresión consistente con el proceso de diferenciación celular observado. En conclusión, los resultados de este trabajo sugieren la necesidad de replantear los estudios donde se han utilizado los genes β-actina y GAPDH como normalizadores. De igual manera, es necesario informar a la comunidad científica sobre la importancia de la validación de los genes normalizadores utilizados en los ensayos de RT-qPCR para la caracterización de estos procesos de diferenciación celular.ABSTRACT The isolation and discovery of new sources for stem cells and their potential applications on regenerative medicine and tissue engineering are based on the evaluation of their multipotentiality. These studies mainly rely on gene expression assays analyzing the regulation of genes involved in the differentiation process. On the other hand, real-time or quantitative RT-PCR (RT-qPCR) has become one of the most common methods for studying these differentiation processes. However, RT-qPCR quantification models require the validation of a reference gene whose expression remains constant under any differentiation treatment in order to compare samples under different culture conditions. In the case of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and despite the number of studies using RT-qPCR for their characterization, there are not studies reporting the validation of normalizer genes to be used in differentiation assays of BMSCs to the osteogenic lineage. This work aimed to study the gene expression stability of the housekeeping genes β-actin, GAPDH and RPLI3A as potential normalizers during the osteogenic differentiation of BMSCs. Their stability was evaluated via RT-qPCR in 14 and 20 day differentiation assays to the osteogenic lineage, and the BMSCs differentiation was evaluated in terms of extracelular matrix mineralization with Alizarin Red S staining and the expression of the osteogenic markers Collagen Type I, Bone Sialoprotein and Osteonectin. The results demonstrated the osteogenic potential of the established BMSCs and the up-regulation of β-actin (p < 0.0001) under osteogenic conditions, with fold changes of 4.38 after 20 days of culture. GAPDH (p = 0.2045) and RPLI3A (p = 0.8384) were not affected by osteogenic media after 14 days of culture with osteogenic media, but expressed small changes in their gene expression levels in the 20 day experiment with maximum fold changes minor than 2. RPLI3A had a greater stability when normalizing as a function of culture time compared to GAPDH, which reflected in expression patterns of the osteogenic markers more consistent with the observed differentiation process. In conclusion, these results suggest the increased performance of RPLI3A as a normalizer gene to be used in differentiation studies of BMSCs to the osteogenic lineage and highlight the importance to create a conscience in the scientific community about the need to validate the normalizer genes used in stem cells characterization via RT-qPCR.PregradoIngeniero(a) Biomédico(a)application/pdfspaUniversidad EIAIngeniería BiomédicaEscuela de Ciencias de la VidaEnvigado (Antioquia, Colombia)Derechos reservados - Universidad EIA, 2008https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessAtribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Evaluación de genes normalizadores para la cuantificación de la expresión génica en ensayos de diferenciación de células madre de médula ósea hacia el linaje osteogénicoTrabajo de grado - Pregradoinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionTexthttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85http://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fCélulas madre mesenquimatosasDiferenciación celularMineralizaciónPublicationORIGINALGarciaFelipe_2008_EvaluacionGenesNormalizadores.pdfGarciaFelipe_2008_EvaluacionGenesNormalizadores.pdfTrabajo de gradoapplication/pdf26462427https://repository.eia.edu.co/bitstreams/e331380a-c31d-42ab-948c-e74d1ccab924/download307787dd716e383a753505142065f5dcMD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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