Evaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115

La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS), o síndrome de Sanfilippo tipo B es una enfermedad neurodegenerativa causada por la deficiencia de la enzima α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU; E.C. 3.2.1.50) que conlleva a la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato en los lisosomas celulares causand...

Full description

Autores:
Bojacá López, Juan Andres
Tipo de recurso:
Trabajo de grado de pregrado
Fecha de publicación:
2022
Institución:
Pontificia Universidad Javeriana
Repositorio:
Repositorio Universidad Javeriana
Idioma:
spa
OAI Identifier:
oai:repository.javeriana.edu.co:10554/61016
Acceso en línea:
http://hdl.handle.net/10554/61016
Palabra clave:
Alfa-N-acetilglucosaminidasa
Mucopolisacaridosis
Komagataella phaffii GS115
Alpha-N-acetylglucosaminidase
Mucopolysaccharidosis
Komagataella phaffii GS115
Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicas
Mucopolisacaridosis
Enzimas
Enfermedades neurodegenerativas
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openAccess
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Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacional
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spelling Atribución-NoComercial-SinDerivadas 4.0 Internacionalhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/info:eu-repo/semantics/openAccessDe acuerdo con la naturaleza del uso concedido, la presente licencia parcial se otorga a título gratuito por el máximo tiempo legal colombiano, con el propósito de que en dicho lapso mi (nuestra) obra sea explotada en las condiciones aquí estipuladas y para los fines indicados, respetando siempre la titularidad de los derechos patrimoniales y morales correspondientes, de acuerdo con los usos honrados, de manera proporcional y justificada a la finalidad perseguida, sin ánimo de lucro ni de comercialización. De manera complementaria, garantizo (garantizamos) en mi (nuestra) calidad de estudiante (s) y por ende autor (es) exclusivo (s), que la Tesis o Trabajo de Grado en cuestión, es producto de mi (nuestra) plena autoría, de mi (nuestro) esfuerzo personal intelectual, como consecuencia de mi (nuestra) creación original particular y, por tanto, soy (somos) el (los) único (s) titular (es) de la misma. Además, aseguro (aseguramos) que no contiene citas, ni transcripciones de otras obras protegidas, por fuera de los límites autorizados por la ley, según los usos honrados, y en proporción a los fines previstos; ni tampoco contempla declaraciones difamatorias contra terceros; respetando el derecho a la imagen, intimidad, buen nombre y demás derechos constitucionales. Adicionalmente, manifiesto (manifestamos) que no se incluyeron expresiones contrarias al orden público ni a las buenas costumbres. En consecuencia, la responsabilidad directa en la elaboración, presentación, investigación y, en general, contenidos de la Tesis o Trabajo de Grado es de mí (nuestro) competencia exclusiva, eximiendo de toda responsabilidad a la Pontifica Universidad Javeriana por tales aspectos. Sin perjuicio de los usos y atribuciones otorgadas en virtud de este documento, continuaré (continuaremos) conservando los correspondientes derechos patrimoniales sin modificación o restricción alguna, puesto que, de acuerdo con la legislación colombiana aplicable, el presente es un acuerdo jurídico que en ningún caso conlleva la enajenación de los derechos patrimoniales derivados del régimen del Derecho de Autor. De conformidad con lo establecido en el artículo 30 de la Ley 23 de 1982 y el artículo 11 de la Decisión Andina 351 de 1993, "Los derechos morales sobre el trabajo son propiedad de los autores", los cuales son irrenunciables, imprescriptibles, inembargables e inalienables. En consecuencia, la Pontificia Universidad Javeriana está en la obligación de RESPETARLOS Y HACERLOS RESPETAR, para lo cual tomará las medidas correspondientes para garantizar su observancia.http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Espejo Mojica, Angela JohanaBojacá López, Juan AndresColombiaCundinamarca (Colombia)Bogotá, D.C. (Bogotá, Colombia)Bogotá (Colombia)2022-07-28T12:27:37Z2022-07-28T12:27:37Z2022-06-08http://hdl.handle.net/10554/61016instname:Pontificia Universidad Javerianareponame:Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javerianarepourl:https://repository.javeriana.edu.coLa mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS), o síndrome de Sanfilippo tipo B es una enfermedad neurodegenerativa causada por la deficiencia de la enzima α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU; E.C. 3.2.1.50) que conlleva a la acumulación del glicosaminoglicano heparán sulfato en los lisosomas celulares causando alteraciones a nivel del sistema nervioso central y anomalías en diferentes órganos y tejidos. Se han propuesto diferentes tratamientos entre los que se encuentra la terapia de remplazo enzimático (TRE), la cual permite la reducción del sustrato acumulado por medio del suministro de proteínas recombinantes activas. Usualmente las proteínas utilizadas para las TRE han sido producidas en células de mamífero, sin embargo, en los últimos años se han evaluado nuevos sistemas de expresión, entre los que destacan las levaduras como Komagataella phaffii (también conocida como Pichia pastoris), la cual presenta ventajas en cuanto a su producción y manejo. La expresión de proteínas recombinantes para aplicaciones biotecnológicas y terapéuticas requiere el uso de sistemas con altos rendimientos de expresión, con esto en cuenta, un microorganismo como Komagataella phaffii necesita de condiciones de cultivo específicas para su crecimiento y posterior producción de las proteínas de interés. En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se han desarrollado investigaciones evaluando el efecto de algunas variables de cultivo como la temperatura, la adición de sustratos y cosustratos en diferentes concentraciones, la disponibilidad de O2 entre otras, con el fin de mejorar la producción de las proteínas recombinantes a escala de biorreactor (1,65L). Adicionalmente, se han evaluado condiciones de cultivo, como la adición de sorbitol y uso de chaperonas farmacológicas, a la misma escala de producción, para la cepa K. phaffii ΔOCH1, para la producción de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS), con el fin de obtener una enzima con N-glicosilaciones humanizadas. Sin embargo, dadas las características morfológicas particulares de esta cepa, se vio la necesidad de realizar en el IEIM una revisión de literatura sobre las posibles estrategias de cultivo que permitan el mejoramiento de la producción de proteínas recombinantes en cepas modificadas genéticamente. Datos colectados en esta revisión mostraron que el uso de co-sustratos durante el proceso de producción pueden contribuir al mejoramiento en la obtención de proteínas recombinantes tanto en cepas modificadas como no modificadas genéticamente. Actualmente, en el IEIM se ha estado trabajando en la producción de la enzima lisosomal alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) tanto en la cepa K. phaffii GS115 como en la cepa ΔOCH1 en medio BMMY a escala de 100 y 400mL en agitación, con los cuales se ha logrado obtener actividades en promedio 0,12 y 0,19 U/mL respectivamente. En el presente estudio, y teniendo en cuenta las sugerencias de Triviño, 2020 sobre el uso de co-sustratos en el proceso productivo, se planteó experimentalmente un diseño factorial de dos niveles (23), con el fin de evaluar el efecto de la adición de metanol, sorbitol y sulfato de amonio como co-sustratos en el medio de cultivo FM22 para la producción de la enzima NAGLU recombinante en la levadura Komagataella phaffii GS115. Esta evaluación se realizó inicialmente a escala de 100mL, con el fin de escoger la condición que mostrara un mejoramiento en la actividad enzimática comparada con la obtenida en el medio de cultivo FM22 estándar utilizado en trabajos previos a escala de biorreactor en el IEIM, en el cual únicamente se adicionaba metanol 0,5%. Adicional a la medición de actividad enzimática en el extracto crudo, se cuantificó la biomasa (g/L) y las proteínas totales producidas (mg/mL). Del resultado de los experimentos del diseño factorial a 100mL, se seleccionó la mejor combinación de las concentraciones de los 3 factores (metanol, sorbitol y sulfato de amonio), y se escaló a 400mL. Todos los experimentos desarrollados en este trabajo se llevaron a cabo por duplicado. Los resultados obtenidos representan la primera evidencia de un aumento de actividad enzimática de NAGLU a partir de la adición de co-sustratos al medio de cultivo FM22 a escala de laboratorio, esto como un primer paso para una posible optimización del proceso de producción a escala de reactor para la obtención de mayores cantidades de proteína recombinante activa que permitan continuar con los esfuerzos en el desarrollo de una TRE para pacientes con MPS IIIB.Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPS), or Sanfilippo syndrome type B, is a neurodegenerative disease caused by deficiency of the enzyme α-N-acetylglucosaminidase (NAGLU; E.C. 3.2.1.50) that leads to the accumulation of the glycosaminoglycan heparan sulphate in cell lysosomes, causing alterations in the central nervous system and abnormalities in different organs and tissues. Different treatments have been proposed including enzyme replacement therapy (ERT), which allows the reduction of the accumulated substrate through the delivery of active recombinant proteins. Usually, the proteins used for ERT have been produced in mammalian cells; however, in recent years new expression systems have been evaluated, including yeasts such as Komagataella phaffii (also known as Pichia pastoris), which has advantages in terms of production and handling. The expression of recombinant proteins for biotechnological and therapeutic applications requires the use of systems with high expression yields. In this regard, microorganisms such as Komagataella phaffii need specific culture conditions for its growth and subsequent production of the proteins of interest. Previous works evaluating the effect of some culture variables such as temperature, the addition of substrates and cosubstrates in different concentrations, the availability of O2, among others, in order to improve the production of recombinant proteins on a bioreactor scale (1.65L) have been carried out at the Institute of Inborn Errors of Metabolism (IEIM). Additionally, the addition of sorbitol and the use of pharmacological chaperones during the production process of the enzyme N-acetylgalactosamine-6-sulphate sulphatase (GALNS) in the modified strain K. phaffii ΔOCH1, have been evaluated at the same production scale. However, due to the fact that this strain presents particular morphological characteristics, it was necessary to conduct a review about improvement strategies of productive process of recombinant proteins in genetically modified strains. Data collected in this review showed that the use of co-substrates during the production process can contribute to the improvement in obtaining recombinant proteins in both genetically modified and non-genetically modified strains. Currently, the IEIM has been working on the production of the lysosomal enzyme alpha-N-acetylglucosaminidase (NAGLU) in both K. phaffii GS115 and ΔOCH1 strains in BMMY medium at 100 and 400mL agitation scale, obtaining volumetric enzymatic activities of 0.12 and 0.19 U/mL, respectively. In the present study, and taking into account the suggestions of Triviño, 2020 about the use of co-substrates in the production process, it was proposed a two-level factorial design (23), which was used to evaluate experimentally the effect of the addition of three factors: methanol, sorbitol and ammonium sulphate, to the FM22 culture medium, on the enzymatic activity of the recombinant protein NAGLU. This evaluation was initially carried out at 100mL scale, in order to choose the best condition that showed an improvement in enzyme activity compared to the standard FM22 culture medium used in previous works at bioreactor scale at the IEIM, in which only 0.5% methanol was added. In addition to measuring enzyme activity in the crude extract, biomass (g/L) and total protein produced (mg/mL) were quantified. The best combination of the concentrations of the 3 factors (methanol, sorbitol and ammonium sulphate) was selected from the results of the 100mL factorial design experiments and scaled up to 400mL. All experiments in this work were carried out in duplicate. The results obtained represent the first evidence of an increase in NAGLU enzymatic activity from the addition of co-substrates to the FM22 culture medium at laboratory scale, as a first step towards a possible optimisation of the production process at reactor scale to obtain larger amounts of active recombinant protein to continue efforts in the development of an ERT for patients with MPS IIIB.Microbiólogo (a) IndustrialPregradoPDFapplication/pdfspaPontificia Universidad JaverianaMicrobiología IndustrialFacultad de CienciasAlfa-N-acetilglucosaminidasaMucopolisacaridosisKomagataella phaffii GS115Alpha-N-acetylglucosaminidaseMucopolysaccharidosisKomagataella phaffii GS115Microbiología industrial - Tesis y disertaciones académicasMucopolisacaridosisEnzimasEnfermedades neurodegenerativasEvaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115Evaluation of the effect of culture conditions on the production of the recombinant enzyme alpha-N-acetylglucosaminidase (rhNAGLU) in Komagataella phaffii GS115Tesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1finfo:eu-repo/semantics/bachelorThesisORIGINALEvaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115.pdfEvaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115.pdfDocumentoapplication/pdf1274557http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/61016/1/Evaluaci%c3%b3n%20del%20efecto%20de%20las%20condiciones%20de%20cultivo%20en%20la%20producci%c3%b3n%20de%20la%20enzima%20recombinante%20Alfa-N-acetilglucosaminidasa%20%28rhNAGLU%29%20en%20Komagataella%20phaffii%20GS115.pdf4a3f90284ea8cadd9b063cb8eb367519MD51open accesscarta autorización (1).pdfcarta autorización (1).pdfLicencia de usoapplication/pdf965484http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/61016/3/carta%20autorizaci%c3%b3n%20%281%29.pdfa53e9f320696ea9a1d413510df0efc5eMD53restricted accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82603http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/61016/4/license.txt2070d280cc89439d983d9eee1b17df53MD54open accessTHUMBNAILEvaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115.pdf.jpgEvaluación del efecto de las condiciones de cultivo en la producción de la enzima recombinante Alfa-N-acetilglucosaminidasa (rhNAGLU) en Komagataella phaffii GS115.pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg4815http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/61016/5/Evaluaci%c3%b3n%20del%20efecto%20de%20las%20condiciones%20de%20cultivo%20en%20la%20producci%c3%b3n%20de%20la%20enzima%20recombinante%20Alfa-N-acetilglucosaminidasa%20%28rhNAGLU%29%20en%20Komagataella%20phaffii%20GS115.pdf.jpgebb4bee65e6623a2196afac6c6906ea0MD55open accesscarta autorización (1).pdf.jpgcarta autorización (1).pdf.jpgIM Thumbnailimage/jpeg8658http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/61016/6/carta%20autorizaci%c3%b3n%20%281%29.pdf.jpg93e8a56184775b7077eb5bb5f926dab5MD56open access10554/61016oai:repository.javeriana.edu.co:10554/610162022-07-29 03:06:23.17Repositorio Institucional - Pontificia Universidad Javerianarepositorio@javeriana.edu.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