Deduccion In-Sílico de la secuencia de la proteína hepática metalotioneina en muestras de Eleutherodactylus Johnstonei en el Valle del Cauca, Cali- Colombia (2013)
Según los reportes históricos mundiales, la presencia de metales pesados ha aumentado dramáticamente desde el advenimiento de la revolución industrial. Algunos de estos metales como Cadmio, Mercurio y Plomo son los metales que más se han relacionado con la muerte y degradación de ecosistemas por eco-toxicidad sobre flora y fauna; y por otro lado se relacionan con las intoxicaciones humanas (tanto agudas como crónicas) que generan daños degenerativos, durante el desarrollo embrionario, juvenil y neurológico a diferentes niveles. Muchos de los focos que concentran estos metales, son los centros industriales, los centros de acopio de basura (sin manejo y reciclado adecuado) y actualmente la minería de oro. Y se hace necesario plantear sistemas de monitoreo de metales pesados, control y manejo de basuras. El conocimiento de la proteína hepática Metalotioneina y el entendimiento de su función principal como agente quelante de metales pesados, es de gran utilidad al permitir analizar los niveles de contaminación y consecuencias que pueden resultar tras la bioaumulación en los organismos vivos. En el ambiente la presencia y los niveles de metales pesados resultan desconocidos, algunos organismos pueden contribuirnos al descubrimiento de nuevos conceptos y los patrones de contaminación a los que nos enfrentamos. Este trabajo tiene como objetivo aislar el DNA complementario de la proteína hepática Metalotioneina que se expresa en ambientes altamente perturbados y contaminados por metales pesados. Para lograr este objetivo se propone el uso de la rana invasora Eleutherodactylus johnstonei para analizar los aspectos moleculares en la rana que evidencie la presencia de esta proteína y así eestablecerla para el 2013 como un organismo bioindicador de la presencia de metales pesados en zonas de la ciudad de Cali. La metodología se encaminó a aislar ARN total, hacer transcripción reversa y amplificación de secuencias por PCR. El aislamiento de ARN total de hígado de la rana Eleutherodactylus johnstonei se refinó al punto de obtener ARN de buena calidad y cualidades verificadas mediante electroforesis de geles desnaturalizantes para ARN las dos bandas características de los ARN ribosomales. Mediante entrenamiento bioinformático de alineamiento de ocho secuencias de metalotioneinas de vertebrados, el uso de una herramienta para el diseño de cebadores y el tamizaje (por búsqueda BLASTN) de los cebadores resultantes del diseño, se obtuvieron tres pares de cebadores degenerados diseñados para metalotioneinas de vertebrados no mamíferos. Las reacciones de transcripción reversa y reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) hechas en este trabajo sumaron un total de 54 reacciones en las que se emplearon combinaciones con los cebadores degenerados diseñados para metalotioneina. Al verificar las reacciones de PCR mediante geles de agarosa no se evidencio (amplicones) bandas bien definidas, a excepción de la reacción en la que el ADNc se hizo empleando el cebador Poly dT, y posteriormente fue amplificado por PCR empleando los cebadores DG2F y DG1R. Sin embargo al someter la secuencia obtenida a una búsqueda BLASTN, esta no tuvo similitud con Metalotioneinas, además de que la secuencia legible solo contó con 25 bases y la otra porción no fue dilucidable. Para este estudio los resultados sugieren que se debe modificar las reacciones RT-PCR y las variables de temperatura de anidamiento de los cebadores o rediseñar cebadores para reforzar la estrategia de obtención de la secuencia.