Identificación y validación funcional de nuevos genes y mutaciones asociadas a la etiología de la insuficiencia ovárica primaria (IOP) : implicación de los genes BMP15, BMPR2, MSH4, ATG7, ATG9A y NOTCH2
La insuficiencia ovárica primaria (IOP) es una patología frecuente que afecta del 1% al 3% de las mujeres de la población general menores de 40 años. No existen datos específicos en la población colombiana, lo cual sería un punto importante a determinar teniendo en cuenta que se ha reportado que est...
- Autores:
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- Fecha de publicación:
- 2018
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- Universidad del Rosario
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- Repositorio EdocUR - U. Rosario
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- Palabra clave:
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Mutaciones
Secuenciación de siguiente generación
Ensayos funcionales
Ginecología & otras especialidades médicas
Insuficiencia Ovárica Primaria
Primary ovarian insufficiency
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Enfermedades de los ovarios
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La insuficiencia ovárica primaria (IOP) es una patología frecuente que afecta del 1% al 3% de las mujeres de la población general menores de 40 años. No existen datos específicos en la población colombiana, lo cual sería un punto importante a determinar teniendo en cuenta que se ha reportado que esta prevalencia puede variar según el origen étnico de las pacientes. La IOP se caracteriza clínicamente por la ausencia (amenorrea primaria) o el cese de la ovulación durante al menos cuatro meses (amenorrea secundaria), con un aumento de los valores plasmáticos de FSH (hormona folículo estimulante). Aunque se han relacionado causas autoinmunes, metabólicas, infecciosas e iatrogénicas, en la mayoría de los casos su etiología es desconocida, lo que sugiere posibles causas genéticas. A pesar de numerosos intentos por determinar estas causas, solo algunos genes han sido relacionados funcionalmente con la etiología de esta enfermedad. En esta tesis de Doctorado se realizó la identificación y la validación de nuevas variantes y/o nuevos genes asociados a la etiología de la IOP. Este trabajo de tesis se divide en dos capítulos, en el primero se describe la identificación de variantes en el gen BMP15 y la evaluación de cómo las mutaciones en este gen contribuyen a la disfunción ovárica. Para esto se evaluó el efecto de 10 mutaciones en BMP15 respecto a la producción del péptido maduro, la activación de la señalización de la vía SMAD y la sinergia con GDF9. La genotipificación de BMP15 en 35 pacientes Colombianas permitió la identificación de una variante nueva (c.986C>G-p.Arg329His) y una variante previamente reportada (c.581T>C, p.Phe194Ser). La evaluación funcional de estas variantes, junto con otras 8 identificadas previamente, indicó que las mutaciones p.Leu148Phe, p.Phe194Ser y p.Tyr235Cys, están relacionadas con la reducción en la producción del péptido maduro. Las mutaciones p.Arg138His, p.Ala180Thr y p.Arg329His redujeron la actividad de BMP15 aproximadamente cuatro veces en relación con la proteína WT (wild type) y las variantes p.Arg68Trp, p.Phe194Ser y p.Asn196Lys redujeron la sinergia de BMP15 con GDF9. Estos resultados sugieren que las mutaciones en BMP15 alteran la función ovárica por diferentes mecanismos. El segundo capítulo se focaliza en la identificación de mutaciones con un efecto moderado/severo que puedan estar potencialmente relacionadas con la etiología de la IOP mediante NGS (secuenciación de siguiente generación). Se tuvieron en cuenta tres aproximaciones: la primera consistió en el diseño de un subset de genes candidatos para la secuenciación específica de la región codificante de 70 genes, la segunda se centró en la secuenciación de exoma en una familia afectada por IOP y la tercera se enfocó en la secuenciación de exoma en pacientes no relacionados (casos no familiares). Estas aproximaciones permitieron la identificación de aproximadamente 60 variantes posiblemente relacionadas con la etiología de la IOP. Adicionalmente, se encontró que algunas pacientes eran portadoras de al menos dos variantes en diferentes genes, este hallazgo refuerza la hipótesis sobre la etiología poligénica de esta enfermedad. Finalmente, se describe la validación funcional de algunas de las mutaciones identificadas. Estos ensayos experimentales in vitro permitieron confirmar que las mutaciones en los genes: BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) y NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val y c.7075C>G-p.Pro2359A) modifican la función cada una de las proteínas WT (wild type). sugiriendo una contribución a la etiología de la IOP. La identificación de nuevos genes y de variantes potencialmente deletéreas, así como su validación a través de estudios funcionales, permitió aportar nuevo conocimiento en la etiología molecular de la IOP. Estos hallazgos pueden ser utilizados para propósitos diagnósticos y/o pronósticos de la enfermedad. |
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Persani L, Rossetti R, Cacciatore C. Genes involved in human premature ovarian failure. J Mol Endocrinol. 2010 Nov;45(5):257–79. European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) Guideline Group on POI, Webber L, Davies M, Anderson R, Bartlett J, Braat D, et al. ESHRE Guideline: management of women with premature ovarian insufficiency. Hum Reprod. 2016 May;31(5):926–37 Bilgin EM, Kovanci E. Genetics of premature ovarian failure. Curr Opin Obstet Gynecol. 2015 Jun;27(3):167–74 Luborsky JL, Meyer P, Sowers MF, Gold EB, Santoro N. Premature menopause in a multi-ethnic population study of the menopause transition. Hum Reprod. 2003 Jan;18(1):199–206 Chang SH, Kim C-S, Lee K-S, Kim H, Yim SV, Lim YJ, et al. Premenopausal factors influencing premature ovarian failure and early menopause. Maturitas. 2007 Sep 20;58(1):19–30 Shelling A, Chapman C, Cree L. The genetics of premature ovarian failure: current perspectives. Int J Womens Health. 2015 Sep;799 Laissue P. 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Aunque se han relacionado causas autoinmunes, metabólicas, infecciosas e iatrogénicas, en la mayoría de los casos su etiología es desconocida, lo que sugiere posibles causas genéticas. A pesar de numerosos intentos por determinar estas causas, solo algunos genes han sido relacionados funcionalmente con la etiología de esta enfermedad. En esta tesis de Doctorado se realizó la identificación y la validación de nuevas variantes y/o nuevos genes asociados a la etiología de la IOP. Este trabajo de tesis se divide en dos capítulos, en el primero se describe la identificación de variantes en el gen BMP15 y la evaluación de cómo las mutaciones en este gen contribuyen a la disfunción ovárica. Para esto se evaluó el efecto de 10 mutaciones en BMP15 respecto a la producción del péptido maduro, la activación de la señalización de la vía SMAD y la sinergia con GDF9. La genotipificación de BMP15 en 35 pacientes Colombianas permitió la identificación de una variante nueva (c.986C>G-p.Arg329His) y una variante previamente reportada (c.581T>C, p.Phe194Ser). La evaluación funcional de estas variantes, junto con otras 8 identificadas previamente, indicó que las mutaciones p.Leu148Phe, p.Phe194Ser y p.Tyr235Cys, están relacionadas con la reducción en la producción del péptido maduro. Las mutaciones p.Arg138His, p.Ala180Thr y p.Arg329His redujeron la actividad de BMP15 aproximadamente cuatro veces en relación con la proteína WT (wild type) y las variantes p.Arg68Trp, p.Phe194Ser y p.Asn196Lys redujeron la sinergia de BMP15 con GDF9. Estos resultados sugieren que las mutaciones en BMP15 alteran la función ovárica por diferentes mecanismos. El segundo capítulo se focaliza en la identificación de mutaciones con un efecto moderado/severo que puedan estar potencialmente relacionadas con la etiología de la IOP mediante NGS (secuenciación de siguiente generación). Se tuvieron en cuenta tres aproximaciones: la primera consistió en el diseño de un subset de genes candidatos para la secuenciación específica de la región codificante de 70 genes, la segunda se centró en la secuenciación de exoma en una familia afectada por IOP y la tercera se enfocó en la secuenciación de exoma en pacientes no relacionados (casos no familiares). Estas aproximaciones permitieron la identificación de aproximadamente 60 variantes posiblemente relacionadas con la etiología de la IOP. Adicionalmente, se encontró que algunas pacientes eran portadoras de al menos dos variantes en diferentes genes, este hallazgo refuerza la hipótesis sobre la etiología poligénica de esta enfermedad. Finalmente, se describe la validación funcional de algunas de las mutaciones identificadas. Estos ensayos experimentales in vitro permitieron confirmar que las mutaciones en los genes: BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) y NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val y c.7075C>G-p.Pro2359A) modifican la función cada una de las proteínas WT (wild type). sugiriendo una contribución a la etiología de la IOP. La identificación de nuevos genes y de variantes potencialmente deletéreas, así como su validación a través de estudios funcionales, permitió aportar nuevo conocimiento en la etiología molecular de la IOP. Estos hallazgos pueden ser utilizados para propósitos diagnósticos y/o pronósticos de la enfermedad.Primary ovarian insufficiency (POI) is a frequent pathology affecting 1% - 3% of women from the general population under 40 years old. There are not specific data related Colombian population, however, this could be an interesting point to be determinate taking account the variation of POI prevalence according ethnical origin. POI is characterized by the absence (primary amenorrhea) or the cessation of ovulation (secondary amenorrhea) for at least four months, as well as high plasmatic levels of FSH (Follicle Stimulating Hormone). Autoimmune, metabolic, infectious and iatrogenic causes have been related to the disease pathogenesis. However, in the majority of cases, the aetiology remains undiscovered. Despite numerous attempts to identify these genetic causes, only a few genes have been functionally related to POI’s etiology. This Ph.D. thesis focuses on the identification and functional validation of new variants and/or new genes related to POI’s etiology. This manuscript is divided in two chapters. The first one describes the identification of new BMP15 variants and the evaluation of how these variants may contribute to ovarian dysfunction. The effect of ten BMP15 mutations in mature peptide production, activation of SMAD signaling and GDF9 synergy were assessed. The BMP15 screening on 35 Colombian patients led to the identification of a new variant (c.986C>G-p.Arg329His) and a previously reported one (c.581T>C, p.Phe194Ser) associated with POI. Assessing the expression/activity of these and other 8 BMP15 mutants allowed to describe that: (1) multiple variants, including p.Leu148Phe, p.Phe194Ser and p.Tyr235Cys reduced mature protein production; (2) other variants (p.Arg138His, p.Ala180Thr and p.Arg329His) displayed lower the activity than wild-type BMP15; and (3) some variants (p.Arg68Trp, p.Phe194Ser and p.Asn196Lys) reduced GDF9 synergy. These results showed that BMP15 mutations can disrupt ovarian function through different mechanisms. The second chapter focuses on the identification of rare variants with a moderate/severe effect potentially related to POI’s etiology. For this purpose, we used NGS (Next Generation Sequencing). We used account three approaches: the first one was performed on a gene subset (n=70). The second one was based on whole exome sequencing (WES) assays in a family affected by POI. The third one was performed using WES in non-related patients (non-familial cases). These approaches led to the identification of approximately 60 variants possibly related to POI’s etiology. Furthermore, the identification of patients with at least two mutations in different genes argued in favor of a polygenic nature of POI. Finally, we performed the functional validation of some mutations. These in vitro assays confirmed that mutations in BMPR2 (c.2960C>T-p.Ser987Phe), MSH4 (c.2355+1G>A-p.Ile743_Arg785del), ATG7 (c.1209T>A-p.Phe403Leu), ATG9A (c.2272C>T-p.Arg758Cys) and NOTCH2 (c.5411C>T-p.Ser1804L, c.6947>T-p.Ala2316Val and c.7075C>G-p.Pro2359A) genes could modify the WT protein function and suggesting contribute to POI etiology.application/pdfhttps://doi.org/10.48713/10336_18243 http://repository.urosario.edu.co/handle/10336/18243spaUniversidad del RosarioFacultad de Ciencias Naturales y MatemáticasDoctorado en Ciencias BiomédicasAtribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 ColombiaAbierto (Texto Completo)EL AUTOR, manifiesta que la obra objeto de la presente autorización es original y la realizó sin violar o usurpar derechos de autor de terceros, por lo tanto la obra es de exclusiva autoría y tiene la titularidad sobre la misma. PARGRAFO: En caso de presentarse cualquier reclamación o acción por parte de un tercero en cuanto a los derechos de autor sobre la obra en cuestión, EL AUTOR, asumirá toda la responsabilidad, y saldrá en defensa de los derechos aquí autorizados; para todos los efectos la universidad actúa como un tercero de buena fe. EL AUTOR, autoriza a LA UNIVERSIDAD DEL ROSARIO, para que en los términos establecidos en la Ley 23 de 1982, Ley 44 de 1993, Decisión andina 351 de 1993, Decreto 460 de 1995 y demás normas generales sobre la materia, utilice y use la obra objeto de la presente autorización. -------------------------------------- POLITICA DE TRATAMIENTO DE DATOS PERSONALES. Declaro que autorizo previa y de forma informada el tratamiento de mis datos personales por parte de LA UNIVERSIDAD DEL ROSARIO para fines académicos y en aplicación de convenios con terceros o servicios conexos con actividades propias de la academia, con estricto cumplimiento de los principios de ley. Para el correcto ejercicio de mi derecho de habeas data cuento con la cuenta de correo habeasdata@urosario.edu.co, donde previa identificación podré solicitar la consulta, corrección y supresión de mis datos.http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/co/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2Persani L, Rossetti R, Cacciatore C. Genes involved in human premature ovarian failure. J Mol Endocrinol. 2010 Nov;45(5):257–79.European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) Guideline Group on POI, Webber L, Davies M, Anderson R, Bartlett J, Braat D, et al. ESHRE Guideline: management of women with premature ovarian insufficiency. Hum Reprod. 2016 May;31(5):926–37Bilgin EM, Kovanci E. Genetics of premature ovarian failure. Curr Opin Obstet Gynecol. 2015 Jun;27(3):167–74Luborsky JL, Meyer P, Sowers MF, Gold EB, Santoro N. Premature menopause in a multi-ethnic population study of the menopause transition. 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Mol Endocrinol. 2006 Nov;20(11):2898–908.instname:Universidad del Rosarioreponame:Repositorio Institucional EdocURInsuficiencia ovárica primariaMutacionesSecuenciación de siguiente generaciónEnsayos funcionalesGinecología & otras especialidades médicas618600Insuficiencia Ovárica PrimariaPrimary ovarian insufficiencyMutationsFunctional assaysNext generation sequencingEnfermedades de los ovariosInsuficiencia Ovárica PrimariaIdentificación y validación funcional de nuevos genes y mutaciones asociadas a la etiología de la insuficiencia ovárica primaria (IOP) : implicación de los genes BMP15, BMPR2, MSH4, ATG7, ATG9A y NOTCH2doctoralThesisTesis de doctoradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06Escuela de Medicina y Ciencias de la SaludORIGINALdocumento tesis.pdfdocumento tesis.pdfapplication/pdf1476781https://repository.urosario.edu.co/bitstreams/f318b723-4dbc-4e1c-b3ce-9ec7e050a267/download7eb6a36fb0dd06a5bb0bd87118fa2f6fMD51CC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8810https://repository.urosario.edu.co/bitstreams/57c5183a-18b8-4f43-8fcb-0a346fd26c89/download9f5eb859bd5c30bc88515135ce7ba417MD53LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain1475https://repository.urosario.edu.co/bitstreams/2296b028-a4a6-4bd1-829a-051cc8c8fa3d/downloadfab9d9ed61d64f6ac005dee3306ae77eMD52TEXTdocumento tesis.pdf.txtdocumento tesis.pdf.txtExtracted texttext/plain69443https://repository.urosario.edu.co/bitstreams/0f0f6da0-54c1-4239-b791-388dece50497/downloadb539987c4d8ea22126565701ced36d5aMD54THUMBNAILdocumento tesis.pdf.jpgdocumento tesis.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg3600https://repository.urosario.edu.co/bitstreams/172b92f5-681e-470e-8fae-bdbec66bdca7/download7eaee4a85e3899a6836b33c479a212bbMD5510336/18243oai:repository.urosario.edu.co:10336/182432019-09-19 07:37:54.609585http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/co/Atribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Colombiahttps://repository.urosario.edu.coRepositorio institucional EdocURedocur@urosario.edu.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 |