Caracterización funcional del canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia (KCa3.1) en el endotelio de la córnea en condiciones fisiológicas y en ambientes hiperglúcidos

La córnea es el lente que protege la superficie anterior del ojo y su transparencia es clave para permitir la visión. Esta característica en gran medida está determinada por la actividad de las células de su capa más profunda, el endotelio corneal. Una monocapa de células hexagonales cuyas caracterí...

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Tipo de recurso:

Fecha de publicación:: 2021

Institución:: Universidad del Rosario

Repositorio:: Repositorio EdocUR - U. Rosario

Idioma:: spa

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Summary:	La córnea es el lente que protege la superficie anterior del ojo y su transparencia es clave para permitir la visión. Esta característica en gran medida está determinada por la actividad de las células de su capa más profunda, el endotelio corneal. Una monocapa de células hexagonales cuyas características morfo-fisiológicas le permiten no solo compensar la tendencia a la sobrehidratación natural que tienen capas más superficiales de la córnea, especialmente el estroma, sino ser un punto clave para el ingreso y la distribución de nutrientes a nivel corneal. Dado que tras el nacimiento el potencial proliferativo de las células endoteliales de la córnea humana es extremadamente limitado, la densidad celular se reduce progresivamente durante la vida, y para restaurar el tejido, las células adyacentes deben migrar y cubrir el área que se ha dañado. Las patologías que afecten, directa o indirectamente, al endotelio corneal aceleran la perdida celular y generan una disfunción que, en última instancia, conlleva a la pérdida de la transparencia corneal haciendo casi imposible la visión, y en la actualidad el único tratamiento disponible es el trasplante. En las últimas décadas, la diabetes mellitus (DM) se ha identificado como una de las enfermedades sistémicas que afectan el endotelio corneal. En estos pacientes se ha descrito un aumento de la paquimetría, una reducción del recuento de células endoteliales respecto a personas sanas de la misma edad y sexo, e incluso diferencias entre pacientes diabéticos de acuerdo con el tiempo de evolución de la enfermedad, además, tras procedimientos quirúrgicos, la alteración de la función de esta barrera ocular y el edema del estroma suelen ser persistentes. Sin embargo, los mecanismos fisiopatológicos por los que la DM afecta el endotelio de la córnea están pobremente descritos. La DM corresponde a un grupo de trastornos metabólicos cuya condición sine qua non es la hiperglicemia. Si bien no es la única causa de hiperglicemia en el ser humano, sí es la que se relaciona con un aumento persistente de la concentración de glucosa en la sangre y otros líquidos extracelulares. Esta situación lleva a complicaciones que afectan preferencialmente células que, como el endotelio corneal, internalizan la glucosa por medio de transportadores de glucosa tipo 1 (GLUT1), es decir por transportadores independientes de los niveles de insulina en sangre, así como ocurre en los eritrocitos, los astrocitos, las neuronas y las células renales, células con las que los tejidos oculares muestran cierta homología desde su origen embrionario (el endotelio deriva de la cresta neural), hasta la fisiopatología, puesto que clínicamente existe concordancia entre el compromiso renal y el ocular. La exposición persistente de las células de todos los tejidos a niveles elevados de glucosa induce lesiones que, en general, están relacionadas con un desbalance en el que la glucosa, y otros metabolitos, se convierten en sustrato de vías metabólicas que usualmente no los utilizan y favorecen el desarrollo de alteraciones morfológicas y funcionales, que una vez se desarrollan son prácticamente irreversibles. Sin embargo, aunque para los tejidos nervioso, cardiovascular y renal la lesión mediada por un microambiente diabético está bien caracterizada, no sucede lo mismo para la córnea y menos aún para el endotelio corneal. Los estudios en diversas poblaciones que han intentado evaluar el impacto de la enfermedad sobre el endotelio, aunque son consistentes en cuanto a los cambios morfológicos, reportan resultados discordantes en cuanto al recuento endotelial y la paquimetría. Por lo anterior, se consideró relevante evaluar el impacto de la diabetes sobre el endotelio mediante modelos estadísticos que permitieran discriminar los cambios asociados a la edad descritos para estas células; en particular, para este análisis era importante identificar el efecto de la enfermedad sobre la densidad celular del endotelio y su capacidad para mantener la deshidratación relativa del estroma y controlar el espesor corneal. Así que se construyó un modelo estadístico con base en una meta-regresión que incluía los tipos de diabetes y la edad como moduladores, para evaluar el impacto real de cada tipo de DM (DM tipo 1 y DM tipo 2) sobre la densidad del endotelio corneal y el espesor de la córnea, determinado por la paquimetría. Este análisis evidenció que el recuento celular se reducía significativamente por la enfermedad, predominantemente en pacientes con DM tipo 1 en quienes el compromiso era independiente de la duración de la enfermedad, y que el aumento del espesor corneal en los pacientes diabéticos era superior al esperado por edad para ambos grupos, independientemente del tipo de diabetes. Estos resultados, que evidenciaban clínicamente el impacto de la hiperglicemia sobre el endotelio, sustentaron la necesidad de evaluar in vitro el efecto que tienen las concentraciones elevadas de glucosa sobre estas células. Particularmente sobre su capacidad de proliferación, su capacidad de migrar para cubrir un defecto y en la inducción de apoptosis, principal tipo de muerte celular identificado hasta el momento en estas células, y el cual ha sido descrito dentro de las respuestas de las células endoteliales frente al estrés oxidativo condición clave dentro de la fisiopatología diabética. Para evaluar los cambios en la capacidad de proliferación de las células del endotelio, se utilizaron cultivos celulares de una línea inmortalizada, las cuales se expusieron al medio definido para ellas como basal y a medios con altas concentraciones de glucosa (55mM). y se hizo seguimiento de la tasa de cambio en la densidad celular mediante ensayos de reducción de MTT [bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio]. En estos experimentos, las células con metabolismo activo convierten el MTT en un producto de color púrpura que una vez solubilizado permite evaluar mediante colorimetría los cambios en la cantidad de células viables. Las pruebas realizadas permitieron evidenciar un aumento en la cantidad de células de los cultivos expuestos a altas concentraciones de glucosa (55mM), mostrando una diferencia significativa tras 24 horas; sin embargo, aunque la diferencia permanecía siendo significativa tras 48 horas, a partir de ese momento el recuento celular medido indirectamente por el método colorimétrico mostraba una reducción progresiva que igualaba la cantidad de células viables a los 5 días para las dos condiciones. La influencia de las distintas concentraciones de glucosa en la capacidad del endotelio para cerrar un defecto de continuidad en la monocapa, se realizó utilizando el método descrito por Liang y colaboradores en 2007 (Liang et al., 2007), en el que se crea un rasguño ("scratch") en una monocapa celular, y se hace seguimiento imagenológico mediante fotografías tomadas desde el momento en que se genera la lesión y a intervalos regulares, hasta que la “herida” cierra. Esto permite comparar el tiempo que le toma a las células del endotelio cerrar el espacio de la lesión bajo diferentes condiciones y cuantificar la tasa de migración de las células. En estos experimentos, se evidenció un retraso significativo de las células expuestas a elevadas concentraciones de glucosa para cerrar el defecto en comparación con células en medios basales. Mientras estas últimas tomaban aproximadamente 5-6 días para cerrar el defecto, para ese momento las células expuestas a niveles elevados de glucosa habían cerrado, en promedio, 50% de la distancia. Por último, la evaluación de apoptosis se realizó mediante un kit comercial (Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche) ) que utiliza la técnica de ELISA (inmunoensayo enzimático) tipo sándwich con anticuerpos monoclonales para histonas con el fin de determinar mono y oligonucleosomas en la fracción citoplasmática de los lisados celulares de cada condición. Estos experimentos evidenciaron que la exposición a elevadas concentraciones de glucosa por 24 horas inducía apoptosis tres veces superior a la que se presentaba en las células en condiciones basales. En la fisiopatología de los procesos deletéreos asociados a la diabetes recientemente se ha identificado la importancia de los procesos electrofisiológicos. En células renales y de la microglía se ha demostrado que los canales de potasio activados por calcio de conductancia intermedia (KCa3.1) parecen tener un papel relevante. Sin embargo, la familia de canales de potasio activados por calcio (KCa) no había sido descrita previamente en el endotelio corneal por lo que fue necesario inicialmente identificar cuales canales de esta familia se expresaban en estas células. Se partió de un análisis bioinformático que permitiera la identificación in silico de estos canales tras lo cual, se comprobó in vitro mediante PCR y en algunos casos Western blot e inmunomarcación la presencia de los canales de potasio activado por calcio de baja conductancia KCa2.2 y KCa2.3, el de conductancia intermedia KCa3.1 y el canal de potasio activado por sodio KNa2.1 (Slick) en las células del endotelio corneal. En el trascurso del desarrollo del presente trabajo, Anumanthan y colaboradores (2018) publicaron un artículo que evaluaba la actividad de KCa3.1 en el estroma de la córnea que incluyó microfotografías que permitían ver marcado el endotelio, lo que reforzó los resultados obtenidos. Se procedió a estudiar que funciones cumplía KCa3.1 en el endotelio en condiciones basales y si estas se modificaban ante la exposición de las células a concentraciones elevadas de glucosa. Estos experimentos que incluyeron la estimulación e inhibición química del canal permitieron identificar la participación de canales KCa3.1 en los procesos de migración, proliferación y apoptosis. KCa3.1, el canal de conductancia intermedia de la familia de canales de potasio activados por calcio, puede ser activado por 1-1-Etil-1,3-dihidro-2H-benzimidazol-2-ona (benzimidazolona) (EBIO-1) y puede ser inhibido selectivamente por 1-[(2-Clorofenil) difenilmetil]-1H-pirazol (TRAM-34). Estos compuestos se utilizaron para probar el efecto de la estimulación e inhibición del canal en la proliferación, migración y apoptosis de las células del endotelio corneal expuesto tanto a condiciones basales como a condiciones hiperglúcidas. La estimulación del canal con EBIO-1 mostró un efecto inhibitorio significativo sobre la proliferación de las células del endotelio cuando se utiliza a concentraciones de 50, 100 y 200 µM, suficiente para contrarrestar el efecto proliferativo identificado en condiciones de alta glucosa durante los primeros días. La inhibición del canal con TRAM-34 a concentraciones de 2, 4 y 8 µM evidenció un efecto contrario, aumentó la proliferación de las células en condiciones basales, especialmente a las concentraciones más altas, y potenció el efecto proliferativo identificado en condiciones de alta glucosa, manteniendo una cantidad mayor de células viables por un tiempo más prolongado. En cuanto a la migración, la estimulación con EBIO-1 redujo la tasa de migración aproximadamente un 50% en condiciones basales y potenció el efecto visto en las condiciones hiperglúcidas. Por el contrario, la inhibición de KCa3.1 con TRAM-34 a 2 µM, aceleró la migración e incluso acercó la tasa de migración de las células en condiciones de alta glucosa a las de las células basales, los efectos son menores a concentraciones mayores. Finalmente, en condiciones basales ninguna de las concentraciones descritas para EBIO-1 y para TRAM-34 aumentaron la tasa de apoptosis; sin embargo, asociadas a medios con elevadas concentraciones de glucosa, EBIO-1 a concentraciones de 100 µM y TRAM_34 a 4 µM sí lo hicieron. En conclusión, este trabajo permitió identificar el compromiso de la diabetes mellitus sobre el endotelio corneal mediante la determinación de su rol en la reducción de la densidad de esta monocapa más allá de la esperada fisiológicamente por la edad, y su impacto en el aumento de la paquimetría, además de identificar un compromiso más severo de los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 respecto a los que cursan con el tipo 2. Adicionalmente, se describió por primera vez la presencia de canales de potasio activados por calcio de conductancia baja, además de confirmar la expresión del canal de conductancia intermedia, y se identificaron en el endotelio corneal los canales de potasio activados por sodio de alta conductancia tipo 2. Por último, se exploró la participación de KCa 3.1 en la proliferación, migración y apoptosis de estas células y se describió su papel como moduladores de estos procesos tanto en condiciones basales como en condiciones de alta glucosa lo cual es relevante tanto en condiciones fisiológicas como en condiciones patológicas, no solo en el escenario de la diabetes sino probablemente en las respuestas ante otros eventos.

Caracterización funcional del canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia (KCa3.1) en el endotelio de la córnea en condiciones fisiológicas y en ambientes hiperglúcidos

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