Producción de Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno, en fermentación sumergida bajo operación batch, una alternativa ambiental para el sector agrícola
Con este proyecto se propone un procedimiento para la producción del enzima Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno la cual posee este enzima que es el responsable de la reducción del nitrógeno disponible a nitrógenos asimilables para las plantas. El primer paso del procedimiento...
- Autores:
-
Uribe Aldana, Nataly
- Tipo de recurso:
- Trabajo de grado de pregrado
- Fecha de publicación:
- 2016
- Institución:
- Universidad ECCI
- Repositorio:
- Repositorio Institucional ECCI
- Idioma:
- spa
- OAI Identifier:
- oai:repositorio.ecci.edu.co:001/3654
- Acceso en línea:
- https://repositorio.ecci.edu.co/handle/001/3654
- Palabra clave:
- Ingeniería agrícola
Química agrícola
Nitrógeno
Nitrogen
Agricultural chemistry
Agricultural engineering
- Rights
- openAccess
- License
- Derechos Reservados - Universidad ECCI, 2016
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Con este proyecto se propone un procedimiento para la producción del enzima Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno la cual posee este enzima que es el responsable de la reducción del nitrógeno disponible a nitrógenos asimilables para las plantas. El primer paso del procedimiento fue aislar la bacteria a partir de un suelo forestal con ayuda de un medio libre de nitrógeno llamado Medio Burk, para luego identificarla morfológica, bioquímica y molecularmente. Los resultados moleculares arrojaron que la bacteria aislada fue Brevundimonas sp., la cual tiene las características de fijación del nitrógeno por medio del enzima nitrogenasa. Seguido se determinó la mejor concentración para los dos componentes del medio Burk encargados de ayudar a expresar el enzima en este caso Na2SO4 y Na2MoO4. Para hallar la concentración que mejor expresará el enzima se modificó las concentraciones en 5 ensayos a los que se les llamo pre inóculos, se llevaron a diferentes rpm de agitación con temperatura de 30ºC, el seguimiento de su crecimiento se evaluó midiendo su absorbancia a 540 nm de 25 a 27 horas, lo cual permitió conocer su velocidad de crecimiento y tiempos de duplicación, en donde se escogió el comportamiento de una curva de crecimiento bacteriano que cumpliera con las fases de la curva de crecimiento bacteriano. Teniendo identificado las concentraciones que mejor expresaron el enzima, se llevaron al medio Burk para ejecutar la fermentación en un biorreactor de 2 litros fabricado en acero inoxidable de 16” el cual está diseñado para trabajar con un multi parámetros llamado GLX proporcionado por la Universidad. El crecimiento de la bacteria en fermentación sumergida bajo operación batch duro tres días, monitoreando parámetros físicos como pH, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono, y conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) como parámetro microbiológico. Terminado los tres días se recuperó la biomasa (Bacteria y enzima expresada) por medio de centrifugación a 6000 rpm por 15 minutos y se contabilizo el enzima total por medio de una curva de proteína teniendo como patrón la gelatina. Esta concentración fue de 1,62 mg/ml. Concluyendo que por cada mililitro de la biomasa recuperada se encuentra 1,62 mg de enzima total. |
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Seguido se determinó la mejor concentración para los dos componentes del medio Burk encargados de ayudar a expresar el enzima en este caso Na2SO4 y Na2MoO4. Para hallar la concentración que mejor expresará el enzima se modificó las concentraciones en 5 ensayos a los que se les llamo pre inóculos, se llevaron a diferentes rpm de agitación con temperatura de 30ºC, el seguimiento de su crecimiento se evaluó midiendo su absorbancia a 540 nm de 25 a 27 horas, lo cual permitió conocer su velocidad de crecimiento y tiempos de duplicación, en donde se escogió el comportamiento de una curva de crecimiento bacteriano que cumpliera con las fases de la curva de crecimiento bacteriano. Teniendo identificado las concentraciones que mejor expresaron el enzima, se llevaron al medio Burk para ejecutar la fermentación en un biorreactor de 2 litros fabricado en acero inoxidable de 16” el cual está diseñado para trabajar con un multi parámetros llamado GLX proporcionado por la Universidad. El crecimiento de la bacteria en fermentación sumergida bajo operación batch duro tres días, monitoreando parámetros físicos como pH, temperatura, oxígeno y dióxido de carbono, y conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) como parámetro microbiológico. Terminado los tres días se recuperó la biomasa (Bacteria y enzima expresada) por medio de centrifugación a 6000 rpm por 15 minutos y se contabilizo el enzima total por medio de una curva de proteína teniendo como patrón la gelatina. Esta concentración fue de 1,62 mg/ml. Concluyendo que por cada mililitro de la biomasa recuperada se encuentra 1,62 mg de enzima total.1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN 14 1.1 Descripción del problema 14 1.2 Formulación del problema 16 2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN 17 2.1 Objetivo general 17 2.2 Objetivos específicos 17 3 JUSTIFICACIÓN 18 4 MARCO DE REFERENCIA 20 4.1 Marco teórico 20 4.2 Marco conceptual 31 4.3 Marco legal 36 4.4 Marco histórico 49 5 TIPO DE INVESTIGACIÓN 51 6 DISEÑO METODOLÓGICO 52 6.1 Escala de laboratorio 53 6.1.1 Aislación y purificación de la cepa 53 6.1.2 Caracterización de la bacteria 53 6.1.3 Pre inoculó 59 6.1.4 Ecuación de Monod 61 6.2 Diseño del biorreactor 63 6.2.1 Parámetros 63 6.2.2 Operación 63 6.2.3 Monitoreo 64 6.3 Escala de banco 64 6.3.1 Puesta en marcha del biorreactor 64 7 ANALISIS DE RESULTADOS 66 7.1 Escala de laboratorio 66 7.1.1 Aislación y purificación de la cepa 66 7.1.2 Caracterización de la bacteria 67 7.1.3 Pre inóculo y evaluación de crecimiento bacteriano 71 7.2 Diseño del biorreactor 77 7.2.1 Parámetros 77 7.2.2 Operación 79 7.2.3 Monitoreo 79 7.3 Recuperación y contabilización de la expresión de enzimas totales 84 7.3.1 Recuperación 84 7.3.2 Cuantificación 85 8 CONCLUSCIONES 87 9 RECOMENDACIONES 88 10 ANEXO 89 11 BIBLIOGRAFIA 101PregradoIngeniero en AmbientalIngeniería Ambiental107 p.application/pdfspaUniversidad ECCIColombiaFacultad de IngenieríasDerechos Reservados - Universidad ECCI, 2016info:eu-repo/semantics/openAccesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2Producción de Nitrogenasa a partir de una bacteria fijadora de nitrógeno, en fermentación sumergida bajo operación batch, una alternativa ambiental para el sector agrícolaTrabajo de grado - Pregradohttp://purl.org/coar/resource_type/c_7a1fTextinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesishttps://purl.org/redcol/resource_type/TPhttp://purl.org/coar/version/c_970fb48d4fbd8a85http://purl.org/coar/version/c_dc82b40f9837b551(Abbott, 2007) Abbott Lynette k., Murphy Daniel V. 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